หลักการและวิธีการ

อาหารสังเคราะห์

อาหารสังเคราะห์สำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

         ปัจจัยที่มีผลต่อความสำเร็จในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชที่สำคัญยิ่งประการหนึ่ง ได้แก่ อาหารสังเคราะห์ที่เตรียมขึ้น เพื่อเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ซึ่งต้องมีความเหมาะสม สามารถส่งเสริมการเจริญของเซลล์และเนื้อเยื่อพืชได้

องค์ประกอบหลักของ อาหารสังเคราะห์สูตรต่างๆ โดยทั่วไป มีดังต่อไปนี้

 1. เกลืออนินทรีย์

ให้แร่ธาตุที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตของพืชทั่วๆไป ได้แก่ ไนโตรเจน (N) ฟอสฟอรัส (P) โพแทสเซียม (K) แคลเซียม (Ca) ซัลเฟอร์ (S) แมกนีเซียม (Mg) เหล็ก (Fe) แมงกานีส (Mn) สังกะสี (Zn) โบรอน (B) ทองแดง (Cu) โคบอลต์ (Co) และโมลิบดีนัม (Mo) บางสูตรเติมไอโอดีน (I) ด้วย ซึ่งพบว่าให้ผลดีสำหรับการเจริญของรากและแคลลัส ชนิดและปริมาณ ของเกลือที่มีแร่ธาตุเหล่านี้ มีความสำคัญต่อการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อและเซลล์พืชมาก เช่น ธาตุไนโตรเจน (N) โดยทั่วไป มักให้อย่างน้อย 25 - 60 มิลลิโมลาร์ ในรูปเกลือไนเทรต แต่ก็พบว่า การใช้เกลือแอมโมเนียม 2 - 20 มิลลิโมลาร์ด้วย ก็จะให้ผลดียิ่งขึ้น สำหรับการเลี้ยงแคลลัสของยาสูบ และการเพาะเมล็ดกล้วยไม้บางชนิด นอกจากนั้น เกลือแอมโมเนียม ยังมีส่วนช่วยรักษาสมดุลของค่า pH หรือระดับความเป็นกรดด่าง ของอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชด้วย เช่นเดียวกับการใช้สารอินทรีย์ แต่บางครั้งพบว่า เกลือแอมโมเนียม อาจมีผลยับยั้งการเจริญ ของเนื้อเยื่อพืชบางชนิดได้ ส่วนธาตุเหล็กมักเตรียมให้อยู่ในรูปที่ละลายน้ำได้ดี โดยรวมกับ ไดโซเดียมอีดีทีเอ เก็บในที่ที่ไม่ถูกแสง ทั้งนี้ เพื่อให้เหล็กอยู่ในรูปที่พืชใช้ได้นาน และทำให้พืช ไม่มีภาวะขาดธาตุเหล็ก

ที่มา https://thai.alibaba.com/

    2. คาร์โบไฮเดรต

ได้แก่ น้ำตาลซึ่งจะให้พลังงานแก่เนื้อเยื่อพืช เพื่อใช้ในการเจริญเติบโตในหลอดทดลอง นิยมใช้ ซูโครส (sucrose) เป็นส่วนใหญ่ ประมาณร้อยละ 2 - 5 โดยน้ำหนัก

    3. วิตามิน

ช่วยให้การทำงานของเอนไซม์ต่างๆ เป็นไปได้อย่างดี ปกติพืชสามารถสังเคราะห์วิตามินได้เอง แต่ในหลอดทดลอง อาจสร้างได้ไม่เพียงพอ จึงมักต้องเติมให้
เสมอๆ คือ ไทอามีน (Thiamine) 0.1 - 1.0 มิลลิกรัมต่อลิตร นอกจากนี้ การให้วิตามินเสริมจำพวกนิโคทินิกแอซิด (Nicotinic acid), ไพริดอกซินไฮโดรคลอไรด์ (Pyridoxine hydrochloride) ไมโออินอซิทอส (myoinositol) โฟลิกแอซิด (folic acid) และแคลเซียมดีเพนโททิเนต (Ca D-pentothenate) เสริมด้วย

ที่มา http://legjoel224.blogspot.com/p/blog-page_2.html    

    4. กรดแอมิโน

กรดแอมิโนเป็นแหล่งให้ไนโตรเจนที่พืชจะได้รับเร็วกว่าจากเกลืออนินทรีย์ แต่ไม่สามารถใช้แทนกันได้ทั้งหมด แม้ว่า กรดแอมิโนจะไม่ใช่สารประกอบที่จำเป็นต้องเติมในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช แต่มีการทดลองที่แสดงว่า การเติมเคซีน-ไฮโดรไลเซต (casein hydrolysate) ร้อยละ 0.02  -  1 ซึ่งประกอบด้วยกรดแอมิโนหลายชนิด ช่วยให้มีการพัฒนาของเนื้อเยื่อเป็นอวัยวะได้ดีขึ้น และมีรายงานการใช้กรดแอมิโน เช่น แอล-ไทโรซีน (L - tyrosine) แอล-อาร์จินีน (L - argenine) แอล-เซอรีน (L - serine) และเอไมด์บางชนิด เช่น แอล-กลูทามีน (L - glutamine) แอล-แอสพาราจีน (L - asparagine) ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช พบว่า มีผลช่วยชักนำให้เกิดยอด ราก และเอ็มบริโอ จากเซลล์ที่ไม่เกี่ยวกับเพศด้วย

ที่มา http://www.thaigreenagro.com/product/productList_2.aspx

    5. กรดอินทรีย์

การเติมกรดอินทรีย์บางตัว โดยเฉพาะที่เซลล์พืชใช้ในวัฏจักร ไทรคาบอกซิเลต Tricarboxylic acid (TCA) ของปฏิกิริยาหายใจ เช่น ซิเทรต (citrate) มาเลต (malate) ซักซิเนต (succinate) หรือ ฟูมาเรต (fumarate) ช่วยให้เซลล์ และโพรโทพลาสต์ของพืชเจริญได้ และยังบรรเทาผลเสีย จากการใช้แอมโมเนียม เป็นแหล่งไนโตรเจนเพียงอย่างเดียว pyruvate มีผลช่วยส่งเสริมการเจริญของเซลล์ที่เลี้ยงในปริมาณน้อยๆ ได้ ส่วน ascorbic acid ช่วยลดการเกิดสีน้ำตาล ของสารประกอบ phenolic ที่เนื้อเยื่อพืชบางชนิดสร้างขึ้น และมีผลยับยั้งการเจริญได้ นอกจากนี้ กรดอินทรีย์บางชนิด เช่น เมส (MES หรือ 2 (N-morpholino) ethane sulphonic acid) ยังช่วยรักษาสมดุล ของความเป็นกรดด่าง ของอาหารสังเคราะห์อีกด้วย

ที่มา http://www.paiagro.com/index.php?lay=show&ac=article&Id=539524340&Ntype=1

6. สารประกอบจากธรรมชาติที่นิยมใช้

เช่น น้ำมะพร้าว กล้วยบด มันฝรั่ง สารสกัดจากมอลต์ สารสกัดจากยีสต์ อิมัลชันปลา ถ่านกัมมันต์ (activated charcoal) สารประกอบจากธรรมชาติเหล่านี้
ในบางครั้ง ไม่สามารถทดแทนกันได้ ด้วยสารอื่นใด ในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช แต่พบว่า ให้ผลดีต่อการเจริญ ของเนื้อเยื่อพืชในหลอดทดลอง บางชนิดยังช่วยทำหน้าที่รักษาสมดุลของความเป็นกรดด่าง และบางชนิด ช่วยดูดซับสารที่เป็นพิษ เนื่องจากมีมากเกินไปด้วย

    7. สารควบคุมการเจริญของพืช
ซึ่งหมายรวมถึงฮอร์โมนพืชด้วย ที่นิยมใช้ ได้แก่ ออกซิน และไซโทไคนิน เนื่องจากจะช่วยกระตุ้นการแบ่งเซลล์ การเจริญเติบโต และการเกิดเป็นโครงสร้าง
ต่างๆ ของเนื้อเยื่อพืชในหลอดทดลอง โดยที่ออกซิน และไซโทไคนิน ที่ใส่ในอาหารสังเคราะห์ จะช่วยเสริมฮอร์โมน ที่เซลล์พืชสร้างขึ้นเอง จากการทดลองเลี้ยงเนื้อเยื่อยาสูบ และพืชอีกหลายชนิด พบว่า ออกซินชักนำให้เกิดแคลลัส และในพืชใบเลี้ยงคู่หลายชนิดพบว่า หากใช้ออกซินร่วมกับไซโทไคนิน จะช่วยให้แคลลัส เพิ่มปริมาณได้ดีขึ้น นอกจากนี้ จากการทดลองศึกษาการสร้างยอดและรากในยาสูบ พบว่า หากได้รับสัดส่วนของปริมาณออกซิน : ไซโทไคนินต่ำ เนื้อเยื่อที่เลี้ยงในหลอดทดลอง จะมีการพัฒนาเป็นยอด และจะพัฒนาเป็นราก เมื่อได้รับสัดส่วน ของปริมาณ ออกซิน : ไซโทไคนินสูง ส่วนการเกิดโซมาติกเอ็มบริโอ เช่น ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อรากแครอตนั้น มักต้องถูกกระตุ้นด้วยออกซิน เช่น ทูโฟร์-ดี (2, 4-D  หรือ 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid) ในปริมาณสูงก่อน แล้วจึงลด หรืองดการให้ออกซิน เพื่อให้เซลล์ของแคลลัสพัฒนา เป็นโซมาติกเอ็มบริโอ การตอบสนองต่อฮอร์โมนในพืชแต่ละชนิด อาจต่างกันได้ ทั้งนี้ ขึ้นอยู่กับชนิดของเนื้อเยื่อ และชนิดของพืช ซึ่งมีระดับฮอร์โมนภายใน ที่แตกต่างกัน ส่วนฮอร์โมน เช่น จิบเบอเรลลินส์ (gibberellins) นำมาใช้เพื่อช่วยให้ยอดเจริญยืดตัวขึ้นได้ แต่มักมีผลยับยั้งการเกิดยอด ราก และโซมาติกเอ็มบริโอ เมื่อใช้ในปริมาณมาก สำหรับสารยับยั้งการเจริญ เช่น แอบซิสซิกแอซิด (abscissic acid) นิยมใช้ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อค่อนข้างน้อย ส่วนสารชะลอการเจริญ เช่น แพกโคลบิวทราโซล (paclobutrazol) อาลาร์ (alar) ฯลฯ ใช้อยู่บ้าง ในกรณีที่ต้องการชะลอการเจริญเติบโตของยอด เพื่ออนุรักษ์พันธุ์พืช ในหลอดทดลอง

ที่มา https://sites.google.com/

    8. สารที่ทำให้อาหารแข็งตัวและวัสดุ พยุงเนื้อเยื่อพืช
โดยทั่วไปมักใช้วุ้น (agar) และเจลาตินผสมลงในอาหารเพื่อทำให้แข็งตัว คุณภาพ และราคา ของสารที่ใช้ทำให้อาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชแข็งตัวมีหลายระดับ
ควรระมัดระวังการใช้สารคุณภาพต่ำ เนื่องจากไอออน แป้ง และไขมัน ที่ปะปนอยู่จะไปทำปฏิกิริยากับองค์ประกอบอื่นๆ ของอาหาร และมีผลยับยั้ง การเจริญของเนื้อเยื่อพืช นอกจากนี้ วัสดุพยุงเนื้อเยื่อ ในกรณีเลี้ยงในอาหารเหลว อาจใช้กระดาษกรอง ที่พับเป็นสะพาน เพื่อวางเนื้อเยื่อพืชไม่ให้จมลงไปใต้อาหารเหลว สำลี และใยสังเคราะห์ ก็สามารถช่วยพยุงเนื้อเยื่อพืชในอาหารเหลวได้

ที่มา http://phiman-planttissue.blogspot.com/

ประโยชน์

ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

คุณสมบัติที่ถูกนำมาใช้ให้เกิดประโยชน์ของวิธีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมีหลายข้อพอสรุปได้ดังนี้

1. สามารถผลิตต้นพันธุ์พืชปริมาณมากในระยะเวลาอันรวดเร็ว ตัวอย่างเช่น หากพืชสามารถเพิ่ม ปริมาณได้ 3 เท่า ต่อการย้ายเนื้อเยื่อลงอาหารใหม่ทุกเดือนๆ ละ 1 ครั้ง เมื่อเวลาผ่านไป 6 เดือน จะสามารถผลิต ต้นพันธุ์พืชได้ถึง 243 ต้น

2. ต้นพืชที่ผลิตได้จะปลอดโรค โดยเฉพาะโรคที่มีสาเหตุจากเชื้อไวรัส มายโคพลาสมา ด้วยการตัด เนื้อเยื่อเจริญที่อยู่บริเวณปลายยอดของลำต้น ซึ่งยังไม่มีท่อน้ำท่ออาหาร อันเป็นทางเคลื่อนย้ายของเชื้อโรค ดังกล่าว

3. ต้นพืชที่ผลิตได้ จะมีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนต้นแม่ คือ มีลักษณะตรงตามพันธุ์ ด้วยการใช้ เทคนิคของการเลี้ยงจากชิ้นตาพืชพัฒนาเป็นต้นโดยตรง หลีกเลี่ยงขั้นตอนการเกิดกลุ่มก้อนเซลล์ที่เรียกว่า แคลลัส

4. ต้นพืชที่ผลิตได้จะมีขนาดสม่ำเสมอ ผลผลิตที่ได้มีมาตรฐานและเก็บเกี่ยวได้คราวละมากๆ พร้อมกัน หรือในเวลาเดียวกัน

5. เพื่อการเก็บรักษาหรือแลกเปลี่ยนพันธุ์พืชระหว่างประเทศ เช่น การมอบเชื้อพันธุ์กล้วยในสภาพปลอดเชื้อ ขององค์กรกล้วยนานาชาติ (INIBAP) ให้กรมส่งเสริมการเกษตร เมื่อปี พ.ศ. 2542

6. เพื่อประโยชน์ด้านการสกัดสารจากต้นพืช นำมาใช้ประโยชน์ด้านต่างๆ เช่น ยาฆ่าแมลง ยารักษาโรค เป็นต้น

 

ที่มา https://sites.google.com/

ที่มา https://sites.google.com/

ที่มา https://tanyamat5651.wordpress.com/

ที่มา  http://www.thaigoodview.com/library/contest2553/type2/science04/24/pages/index5cfa.html

 ปัญหาและอุปสรรคที่พบในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 

   มีการเผยแพร่ผลงานที่เกี่ยวข้องกับหลักการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชกันแต่ไม่ค่อยมีการกล่าวถึงปัญหา และอุปสรรคที่พบ   เมื่อมีการนำมาปฏิบัติจริง  โดยเฉพาะเพื่อการขยายผลในเชิงการค้ากับกลุ่มพืชเศรษฐกิจ มักไม่เป็นไปตามเป้าหมาย ไม่ว่าจะเป็นปัญหาจาก ค่าการลงทุนที่ค่อนข้างสูง ความผิดพลาด ในการชั่งตวงวัดความไม่บริสุทธิ์ของน้ำที่ใช้ เป็นต้นในที่นี้จะกล่าวถึงปัญหาอุปสรรคที่พบเสมอ เฉพาะในส่วนที่เกี่ยวกับลักษณะของต้นพืชระหว่างดำเนินการพอสรุปได้ดังนี้

  1. ความผิดปกติที่เกิดกับต้นพืช  หมายถึง  ต้นพืชจะแสดงลักษณะที่ผิดไปจากสภาพการเจริญเติบโตปกติ อาจมีสาเหตุมาจากวิธีการดำเนินงานในแต่ละขั้นตอนของกระบวนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เช่น การใช้สารเร่งการเจริญเติบโตหรืออื่น ๆ  ในอัตราที่เข้มข้นมากเกินไปเป็นเวลานานเกินไป   หรือแม้แต่การตัดชิ้นพืชที่มีขนาดแตกต่างกันหรือการเว้นระยะห่างระหว่างพืชที่วางในขวดต่างกันล้วนแล้วแต่อาจจะเป็นสาเหตุของความผิดปกติของต้นพืชได้ทั้งสิ้นเช่น

  -- อาการด่างขาว เป็นอาการที่ใบพืชจะเปลี่ยนสีจากเขียวเป็นขาว มีทั้งแบบสีขาวทั้งใบ สีขาวครึ่งใบ    หรือสีขาว ตามขอบใบ

  -- อาการฉ่ำน้ำ (Vitrification) เป็นอาการผิดปกติที่เห็นได้ชัดเจน บริเวณใบจะใสเหมือนแก้ว   อาจมีสาเหตุจาก ปริมาณน้ำภายในเซลล์มากเกินไป ถ้าย้ายออกปลูก มักจะตายในที่สุด

  -- ต้นพืชหยุดเจริญเติบโตด้านความสูง

  -- อาการยอดบิดเบี้ยว ใบแคบเล็ก หรือไม่มีใบ

  -- ต้นพืชมีการเจริญเติบโตและพัฒนาไม่พร้อมกัน ทำให้แผนการเพิ่มปริมาณอาจผิดพลาดไปได้   เนื่องจากต้องคัดเลือกต้นที่มีความสูงมาก เข้าสู่ระยะการชักนำราก ส่วนต้นที่มีความสูงน้อยนำมาเพิ่มปริมาณยอดต่อไปได้               

  2. การปนเปื้อนของเชื้อราและเชื้อแบคทีเรีย ในขวดเนื้อเยื่อพืช

  3. พืชหลายชนิดสามารถขยายเพิ่มปริมาณได้มาก แต่เมื่อถึงระยะสุดท้ายต้นพืชไม่ตอบสนอง  ในระยะการชักนำราก ถึงแม้ว่าจะผ่านการทดสอบในขั้นตอนดังกล่าวแล้ว

  4. ความไม่เป็นปัจจุบันของสายพันธุ์ภายหลังการผลิต-ขยาย บรรลุเป้าหมายแล้ว อาจพบกับกลุ่มไม้ดอก  เนื่องจากความนิยมเรื่องสายพันธุ์ เปลี่ยนแปลงค่อนข้างเร็ว

  5. ความแปรปรวนทางพันธุกรรมของต้นพืช (Somaclonal variation) เป็นลักษณะของต้นพืชที่แตกต่างไปจากเดิม อาจเป็นการเปลี่ยนแปลง โดยถาวรหรือกลับมาเป็นแบบเดิมก็ได้

      ปัญหาต่าง ๆ ดังกล่าวเมื่อเกิดขึ้นแล้วต่างส่งผลให้ต้นพืชเหล่านั้น เจริญเติบโตน้อยลง หรือตายในที่สุด   การหาวิธีแก้ไขคงเป็นไปได้ยาก แต่ควรเริ่มต้นทำงานใหม่ด้วยความระมัดระวัง ในทุกลำดับขั้นตอน ตั้งแต่การฟอกฆ่าเชื้อ วิธีการตัด และวางเนื้อเยื่อพืช สูตรอาหารที่ใช้ เทคนิคปลอดเชื้อ ความสะอาดของเครื่องมือที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว  เป็นต้น แต่ปัญหาอุปสรรคที่เกิดกับงานขยายพันธุ์พืชด้วยวิธีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เป็นปัญหาที่แก้ไขได้ หากปฏิบัติตามหลักเกณฑ์และให้ความสำคัญกับเทคนิคปลอดเชื้อ ผลสำเร็จของงานผลิต-ขยายพันธุ์พืชบรรลุวัตถุประสงค์แน่นอน 

ที่มา http://forum.narandd.com/index.php?topic=1427.0;prev_next=prev#new

ที่มา https://www.kehakaset.com/articles_details.php?view_item=426

ที่มา http://www.pandinthong.com/knowledge-preview/381691791800

ที่มา http://piyapaskritsana.blogspot.com/2011/